對亞硝酸鹽含量檢測的確定與方法驗證

■文/馬曉君

亞硝酸鹽廣泛存在于土壤、水、蔬菜及腌制的動物性食品中,也是廣泛存在于自然環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)。自然界中的很多食物，包括糧食、蔬菜、魚類、蛋類、肉類中都含有亞硝酸鹽。蔬菜是人們?nèi)粘Ｉ钪袛z入量最多的，也是一種易于富集硝酸鹽的植物性作物。

據(jù)國際糧農(nóng)組織1990年統(tǒng)計，人體所需的90%維生素C、60%維生素A均來自蔬菜，蔬菜提供人體所需維生素的同時，也提供了進(jìn)入人體80%～90%的硝酸鹽?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，雖然硝酸鹽對人體沒有直接毒害作用，但過量的硝酸鹽進(jìn)入人體后，在一些酶和微生物作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸镜膩喯跛猁}。亞硝酸鹽是強氧化劑，進(jìn)入血液與血紅蛋白結(jié)合，使氧合血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而失去攜氧能力,導(dǎo)致組織缺氧，而出現(xiàn)一系列缺氧的中毒病癥，嚴(yán)重時可使人死亡。另外，亞硝酸鹽對血管有擴張作用，它還可與胃中的次級胺結(jié)合形成致癌物質(zhì)亞硝酸胺，引起消化系統(tǒng)癌變；亞硝酸鹽也可以通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，引起胎兒畸變。因此,硝酸鹽和亞硝酸鹽含量是評價蔬菜品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

選擇以黃瓜為例的瓜類、以白菜為例的綠葉類、以茄子為例的茄果類蔬菜作為試材。

亞硝酸鹽含量測定

一、溶液配制（GB5009.33-2010）

1、飽和硼砂溶液（50g/L）：稱取5.0g硼酸鈉(Na2B07·10H2O)，溶于100mL熱水中，冷卻后備用。

2、亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）：稱取106.0g亞鐵氰化鉀[K4Fe9(CN)5·3H2O]，用水溶解，并稀釋至1000mL。

3、乙酸鋅溶液（220g/L）：稱220g乙酸鋅[Zn(CH2C00)2·2H2O]，先加30mL冰乙酸溶解，用水稀釋至1000mL。

4、對氨基苯磺酸溶液（4g/L）：稱0.4g對氨基苯磺酸，溶于100mL20%（V/V）鹽酸中，混勻后，至棕色瓶中，避光保存。

5、N-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽溶液(2g/L):稱取0.2gN-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽，溶入少量水中后全部轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻。置于棕色瓶避光保存。

6、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（100g/L）:準(zhǔn)確稱取0.1000g于硅膠干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉，加水移入1000mL容量瓶，加水稀釋至刻度，混勻。

7、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（10g/L）：臨用前，吸取10mL亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100mL容量瓶，加水稀釋至刻度。

所用試劑未注明均為分析純，實驗用水均為去離子水。所有實驗用的玻璃儀器均用去離子水冼滌使其徹底干凈，以確保無外來硝酸根離子(NO3-)和亞硝酸根離子(NO2-)的干擾。

二、標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用國家標(biāo)準(zhǔn)（GB5009.33-2010）鹽酸萘乙二胺法。配制一系列各濃度的亞硝酸鹽溶液：取10ug/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.60mL、2.00mL，分別置于50mL帶塞比色管中。于標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入2mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，放置3-5min，加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，用2cm比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長538nm處測吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用下式計算亞硝酸鹽含量，亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）：

式中：

X1——樣品中亞硝酸鹽的含量（mg/kg）；

M——樣品質(zhì)量（g）；

A1——測定用樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量（μg）；

V0——樣品處理液總體積（mL）；

V1——測定取樣液體積（mL）。

三、回收率的測定

參考馬?。?999）[8]方法，采用加外標(biāo)回收率的方式驗證樣品消解損失程度和方法的準(zhǔn)確度。

四、精密度測定

配制10ug/mL亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取0.8mL的該標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL比色管內(nèi)，按照重氮化偶合法在538nm處重復(fù)測定標(biāo)樣7次，計算吸光度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)平均偏差。

五、數(shù)據(jù)處理

對試驗試數(shù)據(jù)采用Excel及SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。

結(jié)果與分析

一、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

由標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）可知，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性良好，不同濃度的亞硝酸鹽在538nm處的吸光度是呈線性規(guī)律，其回歸方程為y=0.6489x+0.0023，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9997，相對系數(shù)在0.9995以上。

二、樣品前處理條件確定

1、提取溫度和水浴時間對亞硝酸鹽檢測結(jié)果的影響

不同提取溫度和水浴時間對亞硝酸鹽的影響檢測結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，不同溫度下溶液對亞硝酸鹽的溶解量及提取速度存在差異，100℃時，水浴時間45min提取的亞硝酸鹽含量最高；70℃時，水浴時間45min提取的亞硝酸鹽含量最高，但兩種溫度相比70℃水浴下提取的亞硝酸鹽含量更為高，因此提取亞硝酸鹽的最佳水浴條件是70℃的水浴45min。

2、不同顯色時間對亞硝酸鹽檢測結(jié)果的影響

不同顯色時間對亞硝酸鹽檢測結(jié)果的影響測定結(jié)果（見圖3）顯色15min時，亞硝酸鹽含量檢出率最高，之后隨著顯色時間的延長，亞硝酸鹽的吸光度變小，35min后雖稍有上升，但幅度不大。亞硝酸鹽和顯色劑反應(yīng)可生成絡(luò)合物，顯色15min時，其吸光度最大。故宜選擇15min作為顯色時間。

3、活性炭對亞硝酸鹽測定結(jié)果的影響

活性炭對亞硝酸鹽含量的測定結(jié)果（見圖4）可以看出，加入活性炭的試驗組樣品中亞硝酸鹽檢出值為3.50mg/kg，無活性炭的試驗組樣品亞硝酸鹽檢出值為1.00mg/kg，二者差異極顯著?；钚蕴靠上箟难釋喯跛猁}測定的干擾，使得亞硝酸鹽檢出值更為準(zhǔn)確。因此，宜選擇加入活性炭處理，以提高檢出率。

三、方法驗證

樣品亞硝酸鹽回收率試驗測定結(jié)果（見表1）表明，3個樣品的亞硝酸鹽回收率分別為91.11%、91.00%、102.00%，平均回收率為94.63%，相對平均偏差為5.1%。檢出限數(shù)值越低，儀器和方法的靈敏度越高；內(nèi)標(biāo)回收率越高，儀器的準(zhǔn)確度和精密度越高；外標(biāo)回收率越高，消解損失程度越低，方法準(zhǔn)確度越高。在運用分光光度法對樣品進(jìn)行測定時，通常需要測出所用方法的待測元素的回收率，以此評價方法的準(zhǔn)確度和可靠性，回收率越接近1，則方法的可靠性越高。

由精密度試驗測定結(jié)果（見表2）可見，通過重復(fù)測定標(biāo)樣七次和計算吸光度的重復(fù)性，亞硝酸鹽的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.29%，小于2%，表明完全可滿足試驗精密度要求。

采用國標(biāo)（GB5009.33-2010）鹽酸萘乙二胺法測定蔬菜中亞硝酸鹽，樣品前處理的最佳條件是在70℃水浴45min，顯色15min，加入活性炭進(jìn)行消除抗壞血酸處理，平均回收率可達(dá)到94.63%，亞硝酸鹽的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.29%，相對平均偏差為5.1%。

（作者單位：甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心）